Шеньженская ключевая лаборатория метаболического здоровья, Центр энергетического обмена и репродукции, Шэньчжэньский институт передовых технологий, Китайская академия наук, Шэньчжэнь, Китай,
Шэньчжэньский международный институт биомедицинских исследований, Шэньчжэнь, Китай, Шэньчжэнь, Китай,
Факультет фармацевтических наук, Шэньчжэньский университет передовых технологий, Шэньчжэнь, Китай,
Китайско-Европейский центр биомедицины и здравоохранения, Шэньчжэнь, Китай
Андрогенная алопеция (АА) - распространенное заболевание, которое негативно влияет на качество жизни, но по-прежнему трудно поддается эффективному лечению. Выпадение волос, наблюдаемое при АА, является следствием постепенного сокращения продолжительности фазы анагена, сопровождающейся миниатюризацией волосяных фолликулов и последующей атрофией. Этот процесс миниатюризации связан с аномалиями в клетках дермальных сосочков, индуцированных дигидротестостероном (ДГТ). ДГТ индуцирует старение клеток дермальных сосочков (КДС) и способствует апоптозу эндотелиальных клеток сосудов и кератиноцитов через паракринный путь КДС, что в конечном итоге приводит к миниатюризации фолликулов. В этом исследовании ученые разработали многофункциональную платформу адресной доставки на основе экзосом, обозначенную как EX104, с помощью инженерии клеток HEK-293 (HEK-293 (англ. Human Embryonic Kidney 293) — клеточная линия, полученная из эмбриональных почек человека) для экспрессии комбинации терапевтических молекул, включая WNT10B, VEGFA и FGF7. EX104 изменил фенотип миниатюризации волосяных фолликулов в КДС, индуцированных ДГТ. Кроме того, он продемонстрировал значительный стимулирующий рост волос эффект на мышиной модели андрогенной алопеции за счет ремоделирования фолликулярного микроокружения и восстановления миниатюрных волосяных фолликулов. Местное применение EX104 показало, что миноксидил стимулирует рост волос, сравнимый с миноксидилом первой линии, но значительно превосходящий его в стимуляции роста капилляров и пролиферации фолликулов. EX104 представляет собой многообещающую и инновационную стратегию лечения AGA и регенеративной терапии фолликулов.
В этом исследовании продемонстрировано, что обработка EX104 значительно усиливает пролиферацию КДС. Анализ In vitro выявил значительное пролиферативное действие EX104 как на клетки дермальных сосочков человека (чКДС), так и на клетки дермальных сосочков мыши (мКДС). Исследования In vivo показали, что обработка EX104 значительно увеличила количество Ki67-позитивных волосяных фолликулов в коже мышей AGA. Эти данные указывают на то, что EX104 может напрямую отменить ингибирование пролиферации КДС с помощью ДГТ. Во-вторых, было обнаружено, что обработка EX104 значительно увеличивает количество кровеносных сосудов в коже мышей AGA. Этот ангиогенный ответ может восстановить поступление питательных веществ в микроокружение волосяных фолликулов и стимулировать рост волос.
Сконструированная клеточная линия, продуцирующая сконструированную экзосому, была создана путем инфицирования клеток HEK-293 лентивирусом, содержащим три грузовых гена (WNT10B, FGF7 и VEGFA). Впоследствии сконструированные экзосомы были выделены из культуральной среды стабильной клеточной линии с помощью ультрацентрифуги. Для этого исследования были успешно сконструированы два варианта сконструированных экзосом: EX104 и мышиная EX104. EX104 был загружен человеческим FGF7, WNT10B и VEGFA, в то время как мышиный EX104 был загружен их мышиными гомологами. Имитация, в качестве контрольной инженерной экзосомы, из HEK-293 путем заражения лентивирусом, содержащим пустые остовы. Были выделены сконструированные экзосомы и охарактеризовано их распределение по размерам, а также экспрессия эффекторов (FGF7, WNT10B и VEGFΑ).
Результаты исследования показали, что лечение ДГТ продемонстрировало ингибирующий эффект на пролиферацию КДС в зависимости от дозы (рисунки 1 C,D). Соответственно, концентрация ДГТ в 100 мкмоль была выбрана для имитации патологических уровней, наблюдаемых у пациентов с АГА. Результаты показывают, что EX104 обладает способностью заметно усиливать пролиферацию клеток дермальных сосочков человека как в присутствии, так и в отсутствие ДГТ (рисунки 1 B,F). Кроме того, мышиный EX104 продемонстрировал сопоставимые результаты в отношении клеток дермального сосочка мыши (мДГТ) (рисунки 1 A,E). Полученные данные свидетельствуют о том, что EX104 оказывает стимулирующее действие на пролиферацию DPC, в частности, обратное действие на вызванную DHT потерю потенциала репликации DPC.
Рисунок 1.
Влияние EX104 на жизнеспособность DPC, индуцированных ДГТ или без него. Влияние различных концентраций EX104 в отдельности на жизнеспособность MDPC (A) и HDPC (B). Влияние различных концентраций только DHT на жизнеспособность MDPC (C) и HDPC (D). MDPC (E) или HDPC (F) предварительно обрабатывали DHT (100 мкм) в течение 24 ч и затем инкубировали с различными концентрациями мышиного EX104 или EX104 EX104 или без них, соответственно. Жизнеспособность клеток определяли с помощью люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo. Статистический анализ проводился методом однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA). Уровень значимости: *Р < 0,05, **Р < 0,01, ***Р < 0,001, ****Р < 0,0001.
EX104 изменил фенотип миниатюризации волосяных фолликулов в КДС, индуцированных ДГТ
Результаты показали, что ДГТ увеличивал экспрессию мРНК андрогеновых рецепторов (АР), однако это явление было обратимым как в КДС человека, так и в КДС мышей при обработке EX104 и мышиным EX104, соответственно (рисунки 2 A,D). В частности, обработка EX104 привела к снижению экспрессии мРНК АР до уровней, сопоставимых с теми, которые наблюдались в контрольной группе при мКДС.
Рисунок 2
Влияние EX104 на фенотип миниатюризации волосяных фолликулов у КДС, индуцированных ДГТ. мКДС (A-C) и чКДС (D-F) предварительно обрабатывали ДГТ (100 мкм) в течение 24 ч и затем инкубировали с различными концентрациями мышиного EX104 и EX104 или без них в течение 24 ч, соответственно. Затем были собраны цельные клетки с целью определения экспрессии генов DKK1, AR, IL-6 и LEF1 с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени. Статистический анализ проводился с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA). Уровень значимости: *Р < 0,05, **Р < 0,01, ***Р < 0,001, ****Р < 0,0001.
EX104 способствует пролиферации волосяных фолликулов и усилению ангиогенеза
В целом, волосяные фолликулы окружены глубокими сосудистыми сплетениями кожи. Связанные с ними кровеносные сосуды обеспечивают питательными веществами рост и развитие волосяного фолликула. Правильное кровоснабжение необходимо для эффективного роста волосяных фолликулов. Однако кровеносные сосуды регрессируют в волосяных фолликулах лысеющей кожи головы, что может способствовать миниатюризации волосяных фолликулов у пациентов с андрогенной алопецией. Для оценки гистологических изменений у мышей с андрогенной алопецией после лечения препаратом EX104 у всех испытуемых были взяты образцы кожи и исследованы с помощью иммуногистохимии на наличие маркера пролиферации Ki67 и маркера ангиогенеза CD31.
Оценка иммуногистохимического окрашивания CD31 показала, что количество кровеносных сосудов на поле, окружающем кожные сосочки, было значительно увеличено в группе мышей, получавших EX104, и в группе, получавшей миноксидил, по сравнению с контрольной группой (рис. 3А). В частности, количество кровеносных сосудов в группе мышей, получавших EX104, было выше, чем в группе, получавшей миноксидил (рис. 3С). Иммуногистохимическое окрашивание Ki67 показало, что количество Ki67-положительных волосяных фолликулов на поле было значительно увеличено в группе мышей, получавших EX104, и в группе, получавшей миноксидил, по сравнению с контрольной группой (рисунок 3B). И количество Ki67-положительных волосяных фолликулов в группе мышей, получавших EX104, было выше, чем в группе, получавшей миноксидил (рисунок 3D). Это указывает на то, что у мышей EX104 можно индуцировать фазу анагена вместо фазы телогена.
Рисунок 3
Влияние мышиного EX104 на кровеносные сосуды и пролиферирующие волосяные фолликулы у мышей AGA C57BL/6, индуцированных ДГТ. (А) Иммуногистохимическое окрашивание срезов кожи на CD31 с помощью 20-кратного объектива (черные стрелки указывают на CD31-положительные микрососуды). Шкала = 50 мкм. (Б) Иммуногистохимическое окрашивание срезов кожи методом Ki67 с помощью 20-кратного объектива (черные стрелки указывают на волосяные фолликулы, положительные по Ki67). Шкала = 50 мкм. (В) Количественный анализ CD31, окрашивающего окружающие волосяные фолликулы. (D) Количественный анализ окрашивания Ki67 внутри волосяных фолликулов. Статистический анализ проводился методом однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA). Уровень значимости: *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001